Wann und Wo?

Datum: Nach Vereinbarung

Dauer: Nach Vereinbarung

Zeit: 9:00 Uhr bis 16:30 Uhr

Ort: Inhouse

Lernziele

Am Ende des Kurse werden Sie in der Lage sein ihr eigenes PCR-Labor aufzubauen. Sie wissen, wie Sie eine PCR von den Literaturdaten bis hin zur Analyse der PCR-Produkte durchführen können und mit Kenntnisse im PCR-Design können Sie einfache PCR- Assays selbst entwickeln. Die Themen Optimierung und Trouble Shooting helfen Ihnen in schwierigen Situationen.

Zielgruppe

Haben Sie noch nie eine PCR gemacht, dann sind sie hier ebenso richtig, wie PCR-Anfänger, die ihre bisherigen Kenntnisse zu einem soliden Fundament zusammenführen möchten.

Gut zu wissen:

• Wir arbeiten, je nach Teilnehmerzahl in Gruppen mit maximal 2 Personen und jede/jeder hat einen eigenen Pipettensatz, es gibt genug zu tun für jede TeilnehmerIn.
• Wenn Sie jetzt aus der Beschreibung nicht alles verstehen, kein Problem, Sie sollen es ja im Kurs lernen
• Grundsätzlich: es gibt keine schlechten Schüler nur schlechte Lehrer ;-)

Praxis zuerst, die Theorie soll nur erklären was wir tun

Praxisteil I

• Degradierung von genomischer DNA: Demonstration der Bedeutung von Puffer und pH-Stabilität für die Lagerung von DNA.
• Sequenz-Arbeit und Dokumentation: Ausgehend von der Sequenz des Bakteriophage Lambda , suchen wir den vorgegebenen Forward und Reverse - Primer bestimmen die Länge der Amplikone und Berechnen die Annealing -Temperatur für die PCR.
• Pipettierpläne: Wir rechnen! Primer-Konzentrationen, verschiedene Mastermixe und natürlich die Volumina verschiedene Ansätze Pool-Mixe u. a. m..
• Lambda-PCR zur Herstellung eines Größenstandards mit Gelelektrohorese : Aufbau einer Gelelektrophorese, Auswahl der Agarose , Färbung der DNA und Dokumentation.

Praxisteil II

• DNA-Präparation aus Fischstäbchen und eigenem Mundschleimhautabstrich (freiwillig) mit verschiedenen Methoden. Sie sollen verschiedene Methoden kennenlernen mit Vor- und Nachteilen. Quantifizierung im Photometer.
• Einzelmarker eines DNA-Fingerprint PentaE / STR -Marker oder VNTR : wir diskutieren die unterschiedlichen Ergebnisse bei unterschiedlichen DNA-Präparationen, lange Amplikone laufen schlechter als kurze, die PCR kann auch inhibiert sein, was tun (Trouble Shooting)?
• Wir optimieren eine PCR mit einer Primer Magnesium -Konzentrations Reihe. Diskutieren verschiedene Temperatur-Zeit-Profile und Additive für eine Verbesserung einer PCR.

Praxisteil III

• Welcher Fisch war das? Wir amplifizieren ein Stück DNA aus der mtDNA aus Fisch: Unterschied genomische DNA aus Zellkern und mitochrondriale DNA, Restriktionsspaltung und Gelelektrophorese.
• Zu welcher 7-Töchter Evas gehöre ich? Wir amplifizieren ein Stück mtDNA aus menschlicher DNA, präparieren die DNA aus der Gelelektrophorese und bereiten Sie zum Sequenzieren vor. Die Sequenzierung wird extern durchgeführt.
• Besprechung der Ergebnisse online in der Nachbereitung.

Theorieteil

• Aufbau von DNA und RNA und ihre Bedeutung für Stabilität des Templates
• Struktur von DNA/RNA: Manche Sequenzen sind sehr schwer zu amplifizieren woran liegts wie geht man damit um?
• Nomenklatur: Was sind eigentlich die Basen RYW....? Wozu braucht man das?
• Ich kann pipettieren oder tropft bei Ihnen auch immer das Chloroform aus der Spitze ? Ein kleiner Exkurs über richtiges Pipettieren ist immer hilfreich.
• PCR-Geschichte verstehen was Mullis erfunden hat und Khorana nicht so richtig ausgearbeitet hatte.
• Die Anwendungen sind fast schon grenzenlos gerne besprechen wir auch Ihre Anwendung.
• Die Module Genaufbau und Genomaufbau zeigen Ihnen dass DNA nicht gleich DNA ist und unsere Einheit für die Template Menge ist nicht 1 [ng] sondern die Kopienanzahl.

Nachbesprechung

• Zusätzlich biete ich eine gemeinsame Online-Fragestunde für Trouble-Shooting oder weitergehende Fragen an. Die Fragestunde wird mit GoTo-Meeting durchgeführt.

Lernplattform

Eine Lernplattform ( Moodle , e-learning4science.com ) hält für Sie

• das Script als PDF,
• Versuchsbeschreibungen und
• Literatur-Links-Downloads bereit